Bir-Çip-Organ teknolojisi, özel tasarım mikrokanallar içerisinde 3B hücre kültürü yapılmasını ve normalde mevcut deneysel yöntemler ile yapılamayan analizlerin gerçekleştirilebilmesini sağlar.

Abstract

   Organ-on-a-chip technology, a sub-type of microfluidics, is specially designing microchannels in glass or polymer materials for 3D or single cell culturing and performing analysis which is not applicable by current standard methods. The most accepted material for 3B organ modelling inside microfluidics is PDMS since it is air permeable and bio compatible. This material also can be handled by bonding on standard microscope slides or proper plastic holders. Theoretically, gaining a seat in between in-vitro and in-vivo studies, all required organs and metabolic systems can be applied on microfluidic chips. Additionally, extraordinary methods like multiple organs-on-chips (even organism-on-a-chip), single cell analysis, and tumour modelling chip applications are being developed.

Özet

   Mikroakışkan çip (lab-on-a-chip) teknolojisinin bir türevi olan bir-çip-organ (organ-on-a-chip) teknolojisi, cam veya polimer malzemeler içerisinde özel tasarım kanallar açılıp, içerisinde hücre kültürü yapılmasını ve normalde mevcut deneysel yöntemler ile yapılamayan analizlerin gerçekleştirilebilmesini sağlar.

   Çip içerisinde 3B organ kültürü için en çok tercih edilen malzeme, hava geçirgenliği sebebiyle PDMS’dir ve standart mikroskop camına veya uygun plastik alttaşlara bağlı olarak kullanılır. In-vitro ve in-vivo çalışmalar arasında kendisine yer edinmeye başlayan in-chip yöntemlerinde teorik olarak, araştırmacının ihtiyaç duyduğu tüm hedef organlara ve metabolik sistemlere yönelik uygulama geliştirilebilir. Ayrıca, çoklu organ çipi (hatta organizma çipi), hücrelerin tek tek analizi ve tumor modeli vb sıradışı uygulamaların geliştirilmesi de mümkündür. PDMS çiplerdeki mikrokanallar, öncelikle UV litografi ile bir fotorezist malzeme, mekanik işleme ile alüminyum, veya 3 yazıcı ile doğrudan polimer üzerine kalıp işlenmesi ile üretilir. PDMS malzemesi bu kalıp üzerine döküldükten sonra ısıtılarak şekil alır ve çıkartılıp başka bir alttaşa yapıştırıldığında kullanıma hazır hale gelir. Günümüzde çoğunlukla mevcut hücre hatları ile çipler içerisinde doku modellemesi oluşturulurken, primer hücre kültürleri de kullanılabilmektedir.

   Kişiselleştirilmiş tıp ve yeni nesil ilaç geliştiriminde in-vitro yöntemlerin hassasiyetini ve kabiliyetini artırması, in-vivo incelemelerin maliyetinin azaltılması ve deneysel süreçlerde hayvan modellerinin kullanımının azaltılmasında yüksek potansiyeli olması beklenen mikroakışkan çiplerin uygulama örnekleri ve ticari kullanımı her yıl artmaktadır.

1. Giriş

   Günümüzdeki binlerce hastalıktan sadece 500 kadarına ilaç tedavisi mümkündür. Mevcut ilaç geliştirim sürecinde yeni bir ilaca ulaşmak çok uzun sürer ve yüksek maliyetlidir. Ar-ge sürecine adım atılan her yeni ilaç adayından yalnızca %5 kadarı sonuca ulaşıp tedavide kullanılabilir. Yeni ilaç geliştirim ar-ge sürecinin ilk aşamalarında hücre hatları ve hayvan modellerinde başarısı gösterilen aday moleküller, insan klinik testlerinde aynı başarıyı çoğunlukla gösterememektedir. Bu sebeple insanlar üzerindeki testleri kolaylaştıracak ve mümkünse gerçek insan testlerine başlanmadan hedef doku modelleri üzerinden çalışılabilecek yenilikçi bir alternatif araştırma sürecine ihtiyaç duyuluyor. Çözüm olarak, insan organ veya dokularını mimik eden biyomühendislik ürünü aygıtlar yani literatürdeki ismi ile Bir-Çip-Organ (Organ-on-a-Chip) teknolojisi ortaya çıkmıştır.

    İlerleyen bölümlerde de detaylı olarak bahsedileceği üzere bir-çip-organ teknolojisindeki en önemli soru işareti, oluşturulan doku çipi modellerinin gerçek organizmadaki doku metabolizması ve çevresini ne kadar uyumlu benzetebileceğidir. Bu zorluk, temelde kabul edilmiş olup, zaten doku çiplerinin hayvanlar üzerindeki araştırmaları veya insan klinik testlerini tamamen kaldırması beklenmemekte fakat önemli ölçüde azaltması hedeflenmektedir. En azından yakın süreçte.

2. Gereç ve Yöntem

   PDMS mikroakışkan çip üretiminde öncelikle mikrokanalların kalıbı üretilir, sonrasında PDMS kimyasalı sıvı halde monomerlerin karışımı olarak kalıp üzerine dökülerek polimerleştirilir. Mikrokanal kalıbı üretilmesi için tercih ettiğimiz en yüksek çözünürlüklü ve düşük maliyetli yöntem maskesiz UV litografi yöntemidir ve kaynaklar bölümünde kendi hazırladığımız protokol makalelerinde ayrıntılı ve fotoğraflı olarak açıklanmıştır [2-7].

   SU8 fotorezist kimyasalı istenilen mikrokanal yüksekliği miktarınca spin kaplama cihazı ile Si alttaş veya benzeri alttaşlar üzerine kaplanır [2], bilgisayar yazılımı ile çizilen mikrokanal şekilleri maskesiz UV-lazer uygulama cihazı ile uygun çözünürlükte fotorezist malzeme üzerine aktarılır [3] ve PDMS monomerleri karıştırılıp SU8 kalıp üzerine dökülüp ısıtılarak polimerleştirilir [4]. Bu yöntemle oluşturulan PDMS çiplerin bir tarafından kanallar açık kalır ve bir mikroskop camına oksijen plazma uygulaması ile yapıştırılarak son halini alır [5]. PDMS çipler istenirse başka bir PDMS çip üzerine çok boyutlu çip oluşturmak amaçlı kapatılabilir veya çip tutucular ile açılır/kapanır olarak kullanılabilir.

3. Bir-Çip-Organ Teknolojisinde Geliştirim Sürecinin Zorlukları

   Bu konuda herkesin kabul ettiği temel zorluk, dokuların hücresel, fiziksel ve biyokimyasal olarak gerçek çevrelerine ne kadar benzer bir modelin oluşturulabileceğidir. Doku çipinde ya in-vitro çalışmalar gibi hücre hatları kullanılabilir fakat bunların morfolojisinin organizmadaki asıllarına göre uyumluluğu önemli bir soru işaretidir. Diğer bir hücre kaynağı imkanı ise primer doku örnekleridir fakat primer doku örneklerine her kullanımda tekrar tekrar ulaşım bir çok uygulama için mümkün olamaz.

   Bir-çip-organ teknolojisinin ümit verici olmasına rağmen, istenen başarıyı gösterebilmesi için çözülmesi gereken birçok teknik zorluk vardır. Kullanılacak hücre kaynağı ve fiziksel ortamın yanı sıra; birden fazla hücrenin bir arada durması gerekiyorsa bunların nasıl ve ne düzeyde birbiri ile etkileşimli olarak çoğaltılacağı, hücreler arası fiziksel veya sadece moleküler etkileşimin nasıl olacağı, taze besiyerinin nasıl sağlanıp atıkların nasıl atılacağı, birden fazla dokunun aynı çip sisteminde nasıl modelleneceği, ilaç etkisinin çip içerisinde hangi yöntemler ile nasıl ölçüleceği ve benzer belirsizlikler bulunur. Çiplerin biyolojik yönlerine ek olarak mekanik ve elektronik tasarımları ile ilgili de henüz standartlar oluşturulmaya çalışılmaktadır.

4. Tek Tek Hücre-İlaç Etkileşimi Analizi

   Standart hücre kültürü ‘flask’ ve ‘well plate’lerinde yapılan tüm hücre analizlerinde unutmamak gerekir ki o sırada incelenen hücre sayısının yani popülasyonun ortalaması sonuca yansır. Özellikle kanser tedavisi ve kök hücre çalışmalarında örneklerdeki hücresel ve moleküler heterojenite dikkate alınması gereken bir durumdur fakat hücrelerin popülasyondan ayrılıp tek tek incelenebilmesi için ya çoklu ‘well plate’ lere yüksek maliyetli cihazlarla sort edilmelidirler ya da droplet mikroakışkan yöntemi kullanılmalıdır.

   Damlacık (droplet) mikroakışkan çipler, yağ bazlı ve su bazlı akışkanların birbirlerine karışmaması prensibine dayanır. Çip içerisindeki mikrokanallarda, su bazlı besiyeri, yağ bulunan kanallar ile karşılaştığında damlacıklar halinde ayrılır. Bu sayede hücreler, tek bir damlacık halinde çevresinden izole durumda analiz edilebilir. Tümör dokusundaki hücrelerinin, genetik ve fonksiyonel heterojenliği, kanser araştırmalarının, doğru genetik tespitin ve etkili tedavinin önündeki en önemli zorluktur. Aynı durum, embryonik kök hücreler, ‘induced pluripotent’ kök hücre ve bunun gibi hücrelerde transkriptom ve proteom analizleri için de geçerlidir.

   Günümüzde dijital PCR ve ‘single cell transcriptome’ uygulamaları olarak hazır cihazlar bulunmaktadır ve ayrıca özel olarak araştırmacıların ihtiyacına yönelik damlacık mikroakışkan çipler de üretilebilmektedir.

5. Bir-Çip-Karaciğer (Liver-on-a-Chip)

   Karaciğer, sindirim sistemine bağlı ve xenobiyotik moleküllerin metabolize edildiği önemli bir organdır. Hem yeni ilaç adaylarının hem de gıda katkısı gibi kimyasalların insan kullanımından önce karaciğerde metabolizmasındaki rolü incelenmelidir. Hatalı ilaçların, insan klinik testlerinde karaciğere zararı ortaya çıkarsa araştırmacılara ciddi yaptırımlar söz konusu olabilir. İnsan karaciğer dokusu hücrelerinin de hayvan modelleri üzerinden tam olarak anlaşılması mümkün değildir. In vitro hücre hatları da tek yüzeyde çoğaldıkları için, karaciğer dokusuna benzetimde başarılı olamamaktadır.

   Araştırmacılar, karaciğerin fiziksel benzetimi için mikrokanal içerisine sinusoid yerine 50-100 mikronluk girintiler yaptılar ve hepatosit, endotel, Kupfer ve stellate hücrelerini uygun pozisyonlara yerleştirdiler. Hücre olarak yine biyopsiden/kadavradan doku parçaları, iPSC veya hazır hücre hatları kullanılabilir. Bazı araştırmacılar da daha geniş mikrokanallar kullanıp hepatositlerden 3B hücre kültür şekli olan spheroid oluşturup, bu spherodiler ile mikrokanallar içerisinde 3B karaciğer dokusu modellemişlerdir. Bir-çip-karaciğer çalışmalarında henüz yapılmayan uygulama, safra yolunun çip içerisinde modellenmesidir. Bu da sağlandığı takdirde, kolon dokusu çipi ile birleştirilen bir safra yolu dokusu çipi ve karaciğer çipi sayesinde, ilaç veya kimyasalların metabolize edilip vücuttan atılması ile ilgili tüm süreci modelleyecek bir sistem oluşturulabilir.

6. Bir-Çip-Metastaz (Metastasis-on-a-Chip)

   Tümör dokuları üzerine yapılacak testler, tümör hücrelerinin tumorigenesis özelliklerini engellemek üzerine ise, metastaz kabiliyetinin engellenmesi üzerine de çalışmalar yapılır. Mikroakışkan çipler, tek seviye hücre hatlarındaki metastaz modellemelerine göre, hedef dokular aynı çip içerisinde dahil edilerek çeşirli varyasyonlar ölçülebilir, endotel hücre tabakaları in vitro modellere göre daha verimli bir benzetim olduğundan hücrelerin metastatik hareketleri daha başarılı takip edilebilir.

7. Bir-Çip-Deri (Skin-on-a-Chip)

   İnsan derisi, diğer dokuları dış etkilerden koruyan, basınç, sıcaklık ve acı sensörleri bulunduran ve aynı zamanda güneş ışığından D vitamini üreterek metabolizmaya destek olan karmaşık bir organdır. Hipodermis, dermiş ve epidermis tabakaları ile kıl kökü ve ter bezleri gibi yapılardan oluşur. Bir-çip-organ teknolojisinin gelişmesindeki temel sebep olan ilaç geliştirim araştırmalarında hayvan deneylerinin azaltılması ve insan dokusu modellerinin artırılması motivasyonu açısından, bir-çip-deri uygulamasına özel olarak kozmetik araştırmalarında hayvan kullanımının bir çok ülkede tamamen yasaklanması da daha ciddi önem oluşturmuştur.

   Deri dokusu çipi oluşturulurken, kişiye özel tedavi uygulamaları da düşünülerek, hasta kişilerden deri biyopsisi alınarak keratosit kültürü çip içerisinde yapılabilir ve kişiye özel ilaç testi için 3 Boyutlu doku oluşturulabilir. Örneğin sedef hastalarında kişiye uygun ilacın belirlenmesi için bu yöntem kullanılabilir. Daha genel bir ilaç testi uygulamaları veya hastalık modeli oluşturulabilmek için bilinen hücre hatları ile derinin dermis, epidermis ve hipodermis tabakaları çip içerisinde üst üste 3B organ olarak oluşturulabilir. Hücre hatları porlu bir zar üzerinde çoğaltılır ve 3 tabakanın birbiri ile moleküler salınım seviyesinde etkileşimli olarak büyümeleri sağlanır. Birden fazla dokunun birlikte çipe yerleştirilip etkileşimlerinin incelenmesi de bir-çip-organ teknolojisinin önemli bir avantajıdır. Primer hücre kültürü veya hücre hatları ile oluşturulsun, immune hücreleri de çip içerisine verilerek immünolojik interaction modellemesi de yapılabilir. Deri dokusu çipi içerisinde uygun bir tasarımla endotel hücrelerinden damar modellenebilir. Bu sayede peruktan ilaç verildiğinde dolaşıma geçiş düzeyi araştırması gerçeklenebilir. Son bir örnek olarak, dokunma duyusu organı olan deri de sinir hücreleri ile birlikte diğer deri katmanı hücreler birlikte modellenebilir ve bu sayede elektriksel sinyal almak mümkün olursa dokunma duyusu çip içerisinde modellenebilir.

8. Bir-Çip-İlaç Geçirgenliği (Drug Permeability-on-a-Chip)

   Yeni geliştirilen jenerik ve biyobenzer ilaçların, eğer ağızdan sindirim sistemi yoluyla alınımları bekleniyorsa, ilaç geliştirim sürecinde kolondan emilim testleri de vardır. İlaçların barsaklardan emilimi ile ilgili in vitro ve in vivo testler mümkündür. In vivo çalışmalar tavşanlarda yapılır ve hedef ilaç moleküllerinin kandaki miktarı ölçülür. In vitro testlerde ise aday ilaç moleküllerinin mikroporlu bir zar üzerinde tek hat olarak çoğaltılan caco-2 hücrelerinden geçiş miktarı ölçülür. Yeni bir yaklaşım olarak ilaç geçirgenliği çiplerinde hem well plate’lere göre daha az hücre kullanılarak, daha çabuk confluent bir alan elde edilerek zamandan ve maliyetten kazanılır, hem de in vivo modele daha benzer bir 3 boyutlu mikrokanallar oluşturularak hayvan kullanımı azaltılabilir.

9. Yasal Düzenlemeler ve Dünyadaki durum

   Avrupa Parlamentosu, 2010/63/EU kodu ile, bilimsel amaçlı kullanılan hayvanların korunumu konusunda direktif yayınladı [8]. Bu direktif Avrupa Birliği adayı Türkiye için de geçerli olup, özellikle aşağıdaki maddeler açısından önemlidir (Chapter 1, Article 1,4).
– Bilimsel çalışmalarda hayvan kullanımının azaltılması veya değiştirilmesi ve hayvan kullanımının, bakımının, besleniminin ve çoğaltım koşullarının iyileştirilmesi
– Eğer canlı hayvan kullanımına gerek duyulmayacak bilimsel olarak yeterli bir yöntem veya test stratejisi varsa, hayvan kullanımı prosedürü yerine tercih edilmelidir.
– Projenin hedeflerini aksatmayacak düzeyde, kullanılan hayvan miktarı en aza indirilmelidir.

   Türkiye İlaç ve Tıbbi Cihaz Kurumu (TİTCK), 23.05.2005 tarihinde 25823 sayılı yönetmelik ile, kozmetik ürünler üzerinde yapılan hayvan deneylerini yasakladı. Hayvan deneylerinin yasaklanması doğru bir adımdır fakat yerine hangi test ve yöntemlerin getirileceği yine insan sağlığının korunması için önemlidir. Bu açıdan TİTCK 2016 yılında, “kozmetik ürünler üzerinde yapılan hayvan deneylerine alternatif test metotlarına ilişkin kılavuz sürüm 1.0” yayınladı. Bu klavuzun 6. maddesinde; “Hayvan deneyleri arasında yer alan; akut oral toksisite, deri iritasyon, deri korozyon, mukoz membran (göz) iritasyon/korozyon, deri duyarlılığı, deriden emilim, tekrarlanan doz toksisitesi, mutajenisite/genotoksisite, karsinojenisite, üreme toksisitesi testleri gibi testlerin yerine kozmetik ürünler üzerinde yapılması amaçlanan testlerin OECD ve ECVAM tarafından onaylanmış valide edilmiş güncel test metotları olması gerekmektedir” ifadesi ile alternatif test yöntemleri listelenmiştir. Aynı amaç ile Avrupa Komisyonu 6-7 Ekim 2016’da Brükselde “Non-Animal Approaches the Way Forward” isimli bir konferans düzenledi ve raporunu yayınladı [9].

   Raporun temel sonucu Multi-Organ-on-a-Chip ve Human-on-a-Chip teknolojilerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğu yönündedir ve aynı amaçla European Medicines Agency TissUse projesini başlatmıştır. ABD’de ise FDA, Emulate Inc firmasının karaciğer-on-a-chip ürününü, gıda katkı maddeleri üzerinden test etmeye başlamıştır. Bu testlerin başarılı olması durumunda Emulate Inc firması, ilaç, biyoteknoloji, kozmetik, gıda katkıları, tarım kimyasalları, kişiselleştirilmiş tıp ve akademik araştırmalar konularında satışa başlamayı planlamaktadır. Yine ABD’den NIH ise kendisi tüm insan-on-a-chip projesi de bağlatmıştır ve bu kapsamda teker teker multi-organ-on-a-chip çalışmalarını tamamlamaya başlamıştır.

10. Teşekkür

   Bu makale, “X. ULUSLARARASI KATILIMLI TIP BİLİŞİMİ KONGRESİ’nde” bildiri olarak sunulmuştur.

---

Kaynaklar:

[1]Yole Development – 2017 edition: Organs on Chips Market and Technology Report. https://www.i-micronews.com/images/Flyers/MedTech/YDMT17013_Organs-on-Chips_Market_and_ Technology_Report_March_2017_Flyer.pdf Last accessed: 12th August 2017
[2] Sevli S, et.al. Microfluidics Lithography 1: Spin Coating. protocols.io 2017: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.gvgbw3w
[3] Sevli S, et.al. Microfluidics Lithography 2: UV Exposure and Development. protocols.io 2017: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.gwvbxe6
[4] Sevli S, et.al. Microfluidics Lithography 3: PDMS Chip fabrication. protocols.io 2017: https://www.protocols.io/view/microfluidics-lithography-3-pdms-chip-fabrication-gwxbxfn
[5] Sevli S, et.al. Microfluidics Lithography 4: PDMS Microchannel Bonding on Glass. protocols.io 2017: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.gwwbxfe
[6] Yilmaz S, et.al. Microfluidics Lithography 4: How to Use PDMS Microfluidics Chips (with pictures). protocols.io 2017: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.g4xbyxn
[7] Yilmaz S, Set.al. Microfluidics Lithography 6: High Microchannel Thickness (500 µm). protocols.io 2017: https://www.protocols.io/view/microfluidics-lithography-6-high-microchannel-thicg9tbz6n
[8] The European Parliament and the Council of the European Union. Directive 2010/63/EU of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union 2010: L276/33
[9] Cronin M. Non-animal approaches the way forward. Report on a European Commission Scientific Conerence held on 6-7 December 2016 at the Egg 2017: doi 10.2779/373944

---